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RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO



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RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO





Período : agosto /2016 ( x ) PARCIAL

( ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

a janeiro / 2017

Título do Projeto de Pesquisa: Investigação do efeito antioxidante do Açaí (Euterpe oleracea) durante o desenvolvimento de retinopatia diabética em modelos animais acometidos por diabete induzida.

Nome do Orientador: Fernando Allan de Farias Rocha

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Faculdade de Biomedicina

Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Laboratório de Neurofisiologia Eduardo Oswaldo Cruz

Título do Plano de Trabalho: Implementação de sistema de estímulo e registro eletrofisiológico não invasivo para investigação das propriedades visuais.

Nome do Bolsista: Matheus Antonio Rosa

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq

( ) PIBIC/CNPq – AF

( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA

(x ) PIBIC/UFPA AF ( ) PIBIC/ INTERIOR

( ) PIBIC/PRODOUTOR

( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/FAPESPA

( ) PIBIC/PIBIT





  1. INTRODUÇÃO

A retina é o componente do sistema nervoso central responsável por transformar estímulos luminosos em potenciais elétricos a serem interpretados pelo córtex. É constituída por mais de 55 tipos celulares diferentes, comumente divididos em três grupos: fotorreceptores – cones e bastonetes– células fotossensíveis responsáveis por captar a luz e transformá-la em um impulso elétrico; Interneurônios – células bipolares e amácrinas – responsáveis por conduzir o sinal dos fotorreceptores para as células ganglionares; e células ganglionares da retina, que irão conduzir o sinal visual para o córtex (Zhao et al., 2013; Masland, 2001).



Fotorreceptores

Células bipolares

Células amácrinas

Células ganglionares



Figura 1: Representação esquemática da organização da retina. Adaptado de Masland, 2001.
O eletroretinograma (ERG) é um método eletrofisiológico não invasivo que consiste na aquisição de respostas elétricas da retina após a estimulação com um estímulo luminoso. Variados estudos podem ser realizados utilizando essa técnica, uma vez que a onda obtida pode ser decomposta em respostas de diferentes áreas da retina. A onda-a é caracterizada pelas respostas dos fotorreceptores, enquanto a onda-b representa respostas das células bipolares da retina. Dependendo da metodologia utilizada, ainda é possível estudar as respostas isoladas de bastonetes ou grupos de cones (Charng et al., 2013). Graças a grande quantidade de informação que pode ser obtida, esse método é amplamente utilizado para detecção de alterações na retina ocasionados por diversas patologias, como isquemias (Zhao et al., 2013), estresse oxidativo (Brasil et al., 2016), assim como estudos da fisiologia comum da retina.

2. JUSTIFICATIVA:
A proposta deste plano visa instalar um sistema de registro eletrofisiológico não invasivo para dar início a estudos mais acurados sobre a atividade retiniana em modelos animais em nossa região. O sistema de registro aqui proposto tem a vantagem de ser uma ferramenta versátil que pode ser utilizada para medir não somente a atividade padrão da retina, mas também investigar alterações retinianas em diversos modelos animais, como primatas do Novo Mundo, os quais são bastante diversificados na região Amazônica. A intenção de investimento em um sistema eletrofisiológico para registros retinianos vem da recente experiência obtida nos anos de pós-graduação (Doutorado), com trabalhos que foram desenvolvidos graças a uma sólida parceria entre a Universidade Federal do Pará e a Universidade de São Paulo. A cooperação entre as duas universidades possibilitou o conhecimento de diferentes metodologias eletrofisiológicas de investigação na retina e no córtex visual, as quais podem ser agora inseridas integralmente na região amazônica. O proponente do presente projeto teve tese de doutorado totalmente desenvolvida no Laboratório de Psicofisiologia Experimental (USP), a qual gerou trabalhos recentemente publicados em periódicos internacionais de relevância na neurociência visual. Nessa cooperação, houve a possibilidade de trabalhar com registro eletrofisiológico não invasivo, conhecido como eletroretinograma (ERG – Electroretinogram). Os colaboradores incluídos no presente projeto possuem experiência na aplicação de técnicas eletrofisiológicas em humanos, com publicações relevantes em periódicos internacionalmente reconhecidos. Essas técnicas incluem tanto o potencial cortical provocado visual quanto o eletroretinograma de padrão. Perante experiência adquirida com o desenvolvimento destes trabalhos, surgiu a motivação de aplicação dessas metodologias de investigação científica na região Amazônica para a elucidação de perguntas pertinentes de nossa região.
3. OBJETIVOS:


  • Programar um sistema de estimulo e registro de dados eletrofisiológicos não invasivo para investigação de propriedades visuais;

  • Desenvolver rotina virtual de estimulação e registro de dados;



4. MATERIAL E MÉTODOS:

O sistema óptico descrito contem os elementos básicos da maioria dos sistemas ópticos encontrados na literatura. Aqui descreveremos o protótipo de um sistema óptico constituído de dois canais de cor, o qual poderá sofrer modificações ocasionais. O primeiro canal utiliza como fonte de luz uma lâmpada de xenônio de 75W. A luz emitida pela lâmpada tem um espectro de ondas que vai do ultravioleta ao infravermelho. A fonte de luz foi acoplada a um monocromador de luz UV-visível com um fluxo máximo de fótons de 4.6 x 1014 q/s/cm2 em 472 nm. A luz da lâmpada passa inicialmente pelo monocromador, que divide a luz em faixas estreitas de comprimentos de onda. A largura da faixa pode ser ajustada pela regulagem das fendas de entrada e saída de luz. A saída do monocromador será dirigida à entrada de uma fibra óptica. A saída da fibra óptica passa sucessivamente por um obturador eletromagnético, um filtro de densidade neutra, uma lente colimadora, uma íris de fechamento total, um divisor de feixes de quartzo e uma lente fotográfica Nikkor UV de quartzo (Nikon). A imagem formada pelo canal é um circulo de luz com um diâmetro máximo de 2 mm. Para experimentos que envolvem algum tipo de adaptação da retina à luz, um segundo canal óptico foi usado, com um LED como fonte de luz, cujo fluxo máximo de fótons é de 1.2 x 1017 q/s/cm2 de luz. O comprimento de onda para a adaptação pode ser modificado pela troca do LED. A luz do LED passa por uma fibra óptica e sucessivamente por um obturador eletromagnético, uma lente colimadora, e uma íris de fechamento total. O feixe do canal 2 é combinado concentricamente com o feixe do canal 1 pelo divisor. Todos os parâmetros dos estímulos são controlados e documentados por um computador. A saída espectral do sistema óptico do canal 1 é calibrada periodicamente com um radiômetro (International Light Radiometer, modelo 1700, com fotodetector modelo SED033) em todas as combinações possíveis de comprimento de onda e posições do filtro de densidade.


4.1 DESENVOLVIMENTO DE ROTINA VIRTUAL DE ESTIMULAÇÃO
Utilizou-se o software LabView (National Intruments. Austin, TX) para confecção de um instrumento virtual capaz de controlar as amplitudes e frequências do estimulo utilizado, assim como captar e gravar as respostas dos animais. A comunicação do sistema virtual com o equipamento se deu por meio de uma placa daqAssist (Modelo: PCI-6211; National instruments. Austin, Tx).

4.2. PREPARAÇÃO DO ANIMAL


Inicialmente o animal deve ser profundamente anestesiado. Um anestésico muito utilizado em experimentos eletrofisiológicos é o cloridrato de cetamina (Ketalar;) na dose de 6,7 mg/kg com 100 mg/kg de cloridrato de xilazina intramuscular. Em seguida é feita a dilatação da pupila do animal com aplicação tópica de sulfato de atropina (0,04%). É importante definir qual o tipo de adaptação será feito no animal. Caso o experimentador esteja interessado em respostas do ERG que envolvam apenas os cones, faz-se necessário uma adaptação de 10 minutos à luz. No caso do interesse ser em respostas que envolvam os bastonetes 20 mim de adaptação no escuro são necessários.
4.3. REGISTRO
Em experimentos com animais os registros em geral são feitos com um eletrodo de alta condutividade de fibra de prata e náilon (DTL Plus electrode) posicionado dentro da bolsa conjuntiva. Os eletrodos de referência e o terra são posicionados na pálpebra e na orelha. Os registros das respostas são captados com um amplificador AC e ajustados com filtragem de 0,3 Hz (passa baixa) e 300 Hz (passa alta), monitorados com um osciloscópio digital (Tektronix TDS 210), e continuamente digitalizados em uma taxa de 1 KHz por um computador equipado com uma placa de aquisição de dados (National Instruments, Austin, TX).
4.4. PROTOCOLO DE TESTAGEM DO ERG
O protocolo de testagem da ISCEV pode ser utilizado na seguinte sequência: resposta de bastonetes; resposta máxima com o olho adaptado ao escuro; e resposta de cones adaptados à luz.
4.5. RESPOSTAS DE BASTONETES
O sujeito deve ser adaptado ao escuro durante 20 minutos antes do registro do ERG de bastonetes. Flashes apresentados em intervalos de 2 segundos (s) com uma atenuação de 2,5 unidades logarítmicas em relação ao flash de intensidade máxima (0,009 cd.m-2).
4.6. RESPOSTA MÁXIMA (CONES E BASTONETES)
A resposta máxima é obtida com o flash na intensidade máxima (2.8 cd.m-2), repetindo-se o mesmo procedimento utilizado para a resposta dos bastonetes, exceto pelo intervalo entre estímulos que é de 10s. Esta estimulação resulta em uma resposta combinada de cones e bastonetes.
4.7. RESPOSTAS DOS CONES
Os registros dos ERGs mediados pelas respostas dos cones são obtidos após um período de adaptação durante 10 minutos sob luz de fundo; a luminância da luz de fundo pode variar entre 17 e 34 cd.m-2. A intensidade utilizada no flash para as respostas dos cones é máxima. Os intervalos entre os estímulos podem ser variáveis dependendo do experimentador; contudo devem ser maiores que 0,5 s. Os parâmetros do ERG medidos geralmente são: a amplitude da onda-a e a amplitude pico-a-pico, que expressa a diferença entre a onda-a negativa e a onda-b positiva, em microvolts (μV), e o tempo implícito, que expressa (em ms) a latência do tempo de aparecimento dos picos das ondas a e b, após ser dado o estímulo. A partir de medidas eletrofisiológicas feitas em neurônios retinianos de segunda ordem (células horizontais), o Laboratório de Psicologia Experimental desenvolveu uma eficiente maneira de fazer medições da função de sensibilidade espectral S(ʎ) das células fotorreceptoras, chamado de Método da Resposta Constante Dinâmica (de Souza et al. 1996). O princípio do método é a estimulação da retina com um feixe de luz pulsante. Um computador lê a amplitude da resposta celular em voltagem pico a pico e a mantém constante a voltagem da resposta em um nível predeterminado a partir de um controle automático da posição do filtro de densidade neutra, reduzindo ou aumentando a intensidade da luz.
4.8. MEDIDA DE SENSIBILIDADE ESPECTRAL A PARTIR DO ERG
Neste caso a S(ʎ) da célula corresponde à posição do filtro de densidade neutra, após a devida correção pelas calibrações do sistema óptico. A varredura é feita na faixa de 300-700 nm em passos de 4nm sem luz de fundo e em diferentes estados de adaptação cromática. Cada curva da S(ʎ) corresponde à média de aproximadamente 30 varreduras. A frequência do estímulo é ajustada entre 11 e 16 Hz e o critério da resposta 2 mV. Como descrito anteriormente, vimos que a partir do Método da Resposta Constante Dinâmica desenvolvida por de Souza e colaboradores (1996), que utiliza a resposta de registros intracelulares de células horizontais, pode-se obter a curva de sensibilidade espectral dos cones. Nós utilizamos a mesma metodologia para obter curvas de sensibilidade dos fotorreceptores utilizando os registros extracelulares do ERG. A vantagem de usar o ERG para se obter as curvas de sensibilidade é que se trata de uma técnica não invasiva de registro, ou seja, não é necessário o sacrifício de animais nem intervenções cirúrgicas para o registro, podendo ser aplicada teoricamente em qualquer espécie. Este tipo de metodologia já foi utilizada em algumas espécies de roedores (Martins et al., 2006; Rocha et al., 2007) e os resultados obtidos das curvas de sensibilidade espectral foram similares aos descritos na literatura (Jacobs et al., 1991; Jacobs et al., 1996; Jacobs et al., 2001), o que mostrou a confiabilidade do método proposto neste projeto. O princípio do método não será alterado, sendo necessário apenas um ajuste para que o programa leia amplitudes menores de respostas.
5. RESULTADOS:

O sistema desenvolvido mostrou-se eficiente para o estímulo dos animais utilizados (Mus musculus), sendo capaz de gerar diferentes estímulos e captar respostas eletrofisiológicas compatíveis com o esperado e o observado anteriormente em experimentos similares utilizando outro protocolo.




Figura 2: Painel de controle de estímulos e visualização das respostas obtidas desenvolvido no software LabView.


Figura 3: Instrumento virtual (VI - Virtual instrument) desenvolvido para gerar os estímulos necessários e controlar a captação de dados.

O sistema apresentado é bastante flexível, permitindo com que diferentes protocolos sejam testados. Isso garante uma maior possibilidade de experimentos, facilitando adaptações que possam ser necessárias para realizar testes com diferentes espécies.




Figura 4: Série de ERG adquirida com o sistema apresentado.


6. ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES

Devido o objetivo do plano de trabalho foi alcançado ainda na metade da bolsa, nos próximos meses faremos uma mudança no atual plano de trabalho que será voltado para investigar as alterações retinianas em animais com diabetes induzida.



7. CONCLUSÃO:

O ERG é um importante instrumento para estudos da fisiologia do sistema visual, assim como das alterações que podem acometer esse sistema. Essa técnica pode ser utilizada nas mais diferentes espécies. O sistema de estímulo apresentado mostrou-se eficiente para a realização de estudos utilizando esse método, sendo uma importante ferramenta para futuros estudos realizados pelo laboratório.



8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Charng J, Nguyen CT, He Z, Dang TM, Vingrys AJ, et al. (2013) Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. PLOS ONE 8(9): e74172. doi: 10.1371/journal.pone.0074172

Mastland, R. The fundamental plan of the retina. Nature neuroscience, vol. 4, pgs. 877-886, 2001.



McCulloch, Daphne L., Michael F. Marmor, Mitchell G. Brigell, Ruth Hamilton, Graham E. Holder, Radouil Tzekov, and Michael Bach. 2015. ISCEV Standard for full-field clinical electroretinography (2015 update). Documenta ophthalmologica. Advances in ophthalmology 130, no. 1: 1-12.
Zhao Y, Yu B, Xiang YH, Han XJ, Xu Y, et al. (2013) Changes in Retinal Morphology, Electroretinogram and Visual Behavior after Transient Global Ischemia in Adult Rats. PLOS ONE 8(6): e65555. doi: 10.1371/journal.pone.0065555

DIFICULDADES – Nada a declarar.

PARECER DO ORIENTADOR:
O bolsista apresentou um ótimo desempenho finalizando o plano na metade do tempo estipulado. Desta forma julgo como excelente seu desempenho até o momento. Faremos assim uma mudança nesse plano para que o bolsista desenvolva outras habilidades na investigação em neurociências.
DATA: / /



ASSINATURA DO ORIENTADOR


ASSINATURA DO ALUNO

FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA



O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO:

  1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?



  1. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho?



  1. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?



  1. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?



  1. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório



  1. Parecer Final: Aprovado ( )

Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) Reprovado ( )


  1. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5)

Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.

Data : / / .



Assinatura do(a) Avaliador(a)







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