Cultura de células e tecidos

Figura 1.10

 Radioautogramas de glândulas salivares submandibulares de um camundongo que foi injetado com 3H-fucose 8 h antes do sacrifício. A. Ao

microscópio de luz, observam-se grãos negros de prata (setas), que indicam as regiões celulares que estão radioativas. A maior parte da radioatividade está

localizada nos grânulos citoplasmáticos das células dos ductos glandulares. (Médio aumento.) B. Tecido preparado para observação em microscópio eletrônico de

transmissão. Observe os grãos de prata que aparecem como estruturas enoveladas (setas) localizadas principalmente sobre os grânulos citoplasmáticos (G) e no

lúmen (L) dos túbulos. (Grande aumento.) (A e B. Cortesia de T.G. Lima e A. Haddad.)

Enquanto em um organismo complexo as células são banhadas pelo plasma sanguíneo que contém

centenas  de  substâncias  diferentes,  quando  cultivadas  in  vitro  elas  são  cultivadas  em  soluções  de

composição  conhecida  (sais,  aminoácidos,  vitaminas)  às  quais  são  frequentemente  adicionados

componentes  do  soro.  Para  preparar  culturas  de  um  tecido  ou  órgão,  as  células  devem  ser

inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Uma vez isoladas, as

células  podem  ser  cultivadas  em  suspensão  ou  colocadas  sobre  uma  placa  de  Petri  ou  sobre  uma

lamínula de vidro, superfícies sobre as quais as células aderem e crescem sob forma de uma única

camada  de  células  (Figura  1.12  ).  Todos  os  procedimentos  com  células  e  tecidos  vivos  devem

obviamente ser executados em área estéril, usando-se soluções e equipamento estéreis.

Figura 1.11

 Radioautogramas de cortes de órgãos de um rato que foi injetado com 3H-timidina. Os radioautogramas foram expostos durante um tempo muito

longo, e, por essa razão, os núcleos radioativos se tornaram fortemente marcados e aparecem cobertos por uma grande quantidade de grânulos escuros. A. Muitas

células epiteliais estavam se dividindo na base das glândulas intestinais (setas), mas nenhuma no restante das vilosidades. B. Um corte de linfonodo mostra que a

divisão de suas células ocorre principalmente nos centros germinativos desta estrutura (seta). (A e B. Cortesia de Telma M.T. Zorn, Mauricio Soto-Suazo, Cleusa

M.R. Pellegrini e W.E. Stumpf.)

Figura 1.12

 Fotomicrografia de células deciduais de camundongo cultivadas in vitro e observadas por microscopia de contraste de fase. Observam-se várias

células de diferentes formas, algumas arredondadas outras alongadas. Seus núcleos são bem visíveis, e muitos contêm um ou dois nucléolos no seu interior. O

citoplasma ao redor dos núcleos contém muitas organelas. (Médio aumento. Cortesia de Fabiano G. Costa.)

 Para saber mais

Linhagens de células

Culturas feitas com células obtidas diretamente de animais são chamadas 

culturas primárias

. A maioria das células

obtidas  de  tecidos  normais  tem  uma  duração  de  vida  finita,  programada  geneticamente.  Muitos  tipos  de  células

originalmente  isolados  a  partir  de  tecidos  normais  ou  patológicos  e  mantidos  in  vitro  constituem  agora 

linhagens

permanentes  de  células

,  as  quais  podem  ser  mantidas  indefinidamente  em  cultura.  Para  tornar  possível  essa

“imortalidade” de células normais, é necessário submetê-las a um processo chamado de 

transformação

.

 Histologia aplicada

A cultura de células tem sido extensamente usada para o estudo do metabolismo de células normais e cancerosas e

para  o  desenvolvimento  de  novos  fármacos.  Esta  técnica  também  é  útil  para  o  estudo  de  microrganismos  que  só

crescem no interior de células, como os vírus, o Mycoplasma e alguns protozoários.

Em citogenética, a determinação do cariótipo (o número e a morfologia dos cromossomos de um indivíduo) pode ser

realizada pelo cultivo de linfócitos do sangue ou de fibroblastos da pele. Examinando células durante a divisão mitótica,

podem-se  descobrir  anomalias  no  número  e  na  morfologia  dos  cromossomos,  que  podem  ser  correlacionadas  com

várias  doenças  genéticas.  Além  disso,  a  cultura  de  células  é  essencial  para  a  aplicação  de  técnicas  modernas  de

biologia molecular.

 Fracionamento celular

Organelas e outros componentes das células e tecidos podem ser purificados e isolados por meio

de  uma  técnica  chamada  fracionamento  celular.  Trata-se  de  um  processo  físico  pelo  qual  é  usada

força centrífuga para separar organelas e componentes celulares em função  de  seus  coeficientes  de

sedimentação.  O  coeficiente  de  sedimentação  de  uma  partícula  depende  de  seu  tamanho  e  de  sua

forma,  bem  como  da  densidade  e  viscosidade  do  meio  em  que  está  suspensa  (Figura  1.13  ).  A

composição química e as funções das organelas e moléculas podem então ser estudadas in vitro. As

frações obtidas por essas técnicas podem ser analisadas ao microscópio eletrônico para verificar sua

pureza (Figura 1.14 ).

 Histoquímica e citoquímica

Os  termos 

histoquímica

  e 

citoquímica

  são  usados  para  indicar  métodos  que  identificam  e

localizam  substâncias  em  células  e  matriz  extracelular,  seja  em  cortes  histológicos  ou  em  células

cultivadas.  Há  vários  procedimentos  para  obter  essas  informações,  a  maioria  baseada  em  reações

químicas específicas ou em interações de alta afinidade entre moléculas. Esses métodos normalmente

originam  substâncias  insolúveis  coloridas  (para  microscopia  de  luz  )  ou  elétron-densas  (para

microscopia eletrônica).

Figura 1.13

 O fracionamento celular possibilita o isolamento de componentes da célula por meio de centrifugação diferencial. A coluna de desenhos à direita da

figura mostra as organelas celulares obtidas ao fundo de cada tubo após cada centrifugação. A força centrífuga é expressa em unidades g, equivalentes à força da

gravidade. A. Um fragmento de tecido é picado com uma navalha de barbear ou com tesoura e depois dissociado com um homogeneizador ou por ultrassom. B. O

tecido dissociado permanece em repouso durante cerca de 20 min para que grumos não dissociados e fibras da matriz extracelular precipitem. C. O sobrenadante é

centrifugado a 1.000 g por 20 min. Os núcleos são precipitados no fundo do tubo. D. O sobrenadante é centrifugado a 10.000 g por 20 min. Mitocôndrias e

lisossomos precipitam. E. O sobrenadante é centrifugado a 105.000 g por 120 min. Os microssomos precipitam. F. Se o sobrenadante é tratado com desoxicolato de

sódio antes da centrifugação, os microssomos se dissociam e precipitam separadamente como ribossomos e membranas do retículo endoplasmático granuloso.

(Adaptada e reproduzida, com autorização, de Bloom W, Fawcett DW: A Textbook of Histology, 9th ed. Saunders, 1968.)

Figura 1.14

 Micrografias eletrônicas de três frações celulares isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. A. Fração de mitocôndrias contaminada

com retículo endoplasmático. B. Fração de microssomos. C. Fração de lisossomos. (Grande aumento. Cortesia de P. Baudhuin.)

 Íons

Vários  íons  (p.  ex.,  cálcio  ,  ferro,  fosfato)  podem  ser  localizados  em  tecidos,  usando  reações

químicas que produzem produtos insolúveis escuros ou coloridos (Figura 1.15 ).

 Ácidos nucleicos

O  DNA  pode  ser  identificado  e  quantificado  nos  núcleos  das  células  por  meio  da  reação  de

Feulgen, que produz cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA também podem ser evidenciados pela

coloração de células ou cortes de tecidos com corante básicos.

 Proteínas

Embora  haja  métodos  gerais  para  detectar  proteínas  em  células  e  cortes  de  tecidos,  os  métodos

histoquímicos  normalmente  não  possibilitam  localização  de  proteínas  específicas,  o  que  pode  ser

feito pela 

imunocitoquímica

 (ver mais adiante neste capítulo).

Há,  porém,  vários  métodos  histoquímicos  que  revelam  com  maior  ou  menor  especificidade  um

grupo grande de proteínas, as enzimas.

 Para saber mais

Métodos histoquímicos para detecção de enzimas em cortes

Estes métodos geralmente aproveitam a capacidade das enzimas para reagir com ligações químicas específicas.

A maioria dos métodos histoenzimáticos funciona do seguinte modo:

• Cortes de tecidos são imersos em uma solução que contém o substrato da enzima cuja existência se quer verificar, e,

dessa maneira, é possível que a enzima existente nas células ou matriz interaja com seu substrato

• O corte é posto em contato com uma substância marcadora que reage com uma molécula resultante da degradação ou da transformação do substrato

• O produto final da reação, que deve ser insolúvel, precipita sobre o local que contém a enzima, denunciando-a; esse

produto final deve ser colorido ou elétron-denso para ser visível por microscopia de luz ou eletrônica.

Ao  examinar  um  desses  cortes  ao  microscópio,  é  possível  observar  as  células  (ou  organelas)  cobertas  com  um

material colorido ou elétron-denso.

Alguns exemplos de enzimas que podem ser detectadas são:

 

Fosfatases:

  são  enzimas  amplamente  encontradas  no  organismo.  Elas  clivam  a  ligação  entre  um

grupo  fosfato  e  um  resíduo  de  álcool  de  moléculas  fosforiladas.  O  produto  final  da  reação  é

insolúvel  e  colorido,  geralmente  fosfato  ou  sulfeto  de  chumbo.  Por  essas  técnicas  podem-se

detectar  fosfatases  alcalinas  que  têm  sua  atividade  máxima  em  um  pH  alcalino  (Figura  1.16  ).

Frequentemente  se  usa  uma  reação  de  detecção  de  fosfatases  ácidas  para  demonstrar  por

microscopia  de  luz  ou  eletrônica 

lisossomos

,  organelas  citoplasmáticas  que  contêm  grande

quantidade dessas enzimas (Figura 1.17 )

Figura 1.15

 Fotomicrografia de um corte de osso tratado por uma técnica histoquímica para demonstrar íons cálcio. Os precipitados escuros na parte inferior da

figura indicam a existência de fosfato de cálcio no osso e na cartilagem calcificada . Tecido cartilaginoso não calcificado (corado em alaranjado) está na metade

superior da figura. (Médio aumento.)

Figura 1.16

 Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de Gomori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. As regiões em que essa enzima é

encontrada aparecem escuras em razão do precipitado de sais de chumbo (setas). (Médio aumento.)

 

Desidrogenases:

  removem  hidrogênio  de  um  substrato  e  o  transferem  a  outro.  Há  muitas

desidrogenases nas células, onde elas têm um papel importante em vários processos metabólicos. A

demonstração  histoquímica  de  desidrogenases  consiste  em  incubar  cortes  de  tecidos  não  fixados

em uma solução que contém uma molécula que, ao receber hidrogênio, precipita sob forma de uma

substância colorida insolúvel. Por esse método, a succinodesidrogenase – enzima fundamental  do

ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs) – pode ser localizada nas mitocôndrias

 

Peroxidase

:  a  peroxidase,  existente  em  vários  tipos  celulares,  é  uma  enzima  que  promove  a

oxidação de certos substratos e a transferência de íons de hidrogênio para peróxido de hidrogênio,

produzindo ao mesmo tempo moléculas de água. A atividade de peroxidase em células de sangue ,

que é importante no diagnóstico de leucemias, pode ser evidenciada por esse método. Uma vez que

a peroxidase é uma enzima extremamente ativa e produz rapidamente uma quantidade apreciável de

precipitado  insolúvel,  ela  tem  uma  importante  aplicação  prática:  ser  usada  para  marcar  outras

moléculas.  Moléculas  de  peroxidase  podem  ser  extraídas  de  vegetais,  isoladas  e  acopladas  com

outras  moléculas.  Mais  adiante  neste  capítulo  serão  estudadas  várias  aplicações  da  marcação  de

moléculas com peroxidase.

 Para saber mais

Como se faz a detecção de peroxidase

Para a detecção de peroxidase, células ou cortes de tecido são incubados em uma solução que contém peróxido de

hidrogênio e 3,3-diaminoazobenzidina. Esta última substância é oxidada na presença de peroxidase, resultando em um

precipitado insolúvel marrom ou elétron-denso que possibilita a localização da atividade de peroxidase em microscópios

de luz e eletrônicos.

 Polissacarídios e oligossacarídios

Os polissacarídios  do  nosso  organismo  existem  livre  s  ou  combinados  com  proteínas  e  lipídios.

Quando combinados, eles constituem um grupo de moléculas heterogêneo e extremamente complexo.

Eles  podem  ser  demonstrados  pela  reação  de  ácido  periódico-Schiff  (PAS),  que  se  baseia  na

transformação  de  radicais  1,2-glicol  encontrados  nos  açúcares  em  resíduos  de  aldeído.  Esses

resíduos são, em seguida, revelados pelo reagente de Schiff, que produz uma coloração púrpura ou

magenta nos locais do corte em que há muitos polissacarídios.

Um polissacarídio livre muito encontrado no organismo é o glicogênio, que pode ser demonstrado

pela reação de PAS em fígado, músculo estriado e outros tecidos em que se acumula.

Glicoproteínas

 são moléculas de proteínas associadas a cadeias pequenas e ramificadas de açúcares

(oligossacarídios).  A  cadeia  proteica  predomina  em  peso  e  volume  sobre  a  cadeia  de

oligossacarídio.  Enquanto  algumas  glicoproteínas  não  contêm  nenhum  grupo  ácido  (glicoproteínas

neutras)  e  são  PAS-positivas,  outras  têm  radicais  carboxila  ou  sulfato.  A  Figura  1.18  mostra

estruturas coradas pela reação de PAS.

Figura 1.17

 Detecção de fosfatase ácida. Micrografia eletrônica de uma célula de rim de rato que mostra três lisossomos (L) junto de um núcleo (N). O

depósito escuro no interior dos lisossomos é fosfato de chumbo que precipitou nos locais em que havia fosfatase ácida. (Grande aumento. Cortesia de E.

Katchburian.)

Glicosaminoglicanos

  são  polissacarídios  não  ramificados,  fortemente  aniônicos,  que  contêm

monossacarídios  aminados  (aminoaçúcares).  Quando  um  grande  número  de  cadeias  de

glicosaminoglicanos  se  prende  ao  longo  de  um  eixo  proteico,  elas  constituem  os  proteoglicanos.

Alguns  dos  componentes  mais  importantes  da  matriz  extracelular  do  tecido  conjuntivo  são

proteoglicanos  (ver  mais  detalhes  sobre  essas  moléculas  nos  Capítulos  5  e  7).  Diferentemente  das

glicoproteínas, nos proteoglicanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da

molécula.  Glicosaminoglicanos  e  glicoproteínas  ácidas  são  fortemente  aniônicas  por  causa  do  seu

alto  conteúdo  de  grupos  carboxila  e  de  sulfato.  Por  essa  razão,  eles  reagem  intensamente  com  o

corante alcian blue.

 Lipídios

O melhor meio utilizado para revelar lipídios são os corantes que são solúveis em lipídios. Cortes

obtidos  por  congelação  são  imersos  em  soluções  alcoólicas  saturadas  com  esses  corantes  (os

corantes sudan IV e sudan black são os mais usados). O corante se dissolve nas gotículas de lipídios,

as  quais  adquirem  a  cor  do  corante.  Métodos  adicionais  usados  para  a  localização  de  colesterol  e

seus ésteres, de fosfolipídios e de glicolipídios são úteis para diagnosticar doenças metabólicas em

que há acúmulo intracelular de diferentes tipos de lipídios.

Figura 1.18

 Fotomicrografia de vilosidades intestinais coradas pela técnica de ácido periódico-Schiff (PAS). No epitélio de revestimento simples cilíndrico que

reveste essas vilosidades, há células secretoras de muco denominadas células caliciforme s. A secreção dessas células aparece intensamente corada pelo PAS

devido ao alto conteúdo de polissacarídios do muco. Essas células têm a forma de uma taça de vinho, em que o pé da taça contém o núcleo e a porção alargada, a

secreção . A intensa coloração de uma faixa na superfície das células do revestimento epitelial é chamada bordadura estriada, que é constituída por uma grande

quantidade de microvilosidades em cuja superfície existem muitos polissacarídios. Corte contracorado com hematoxilina para demonstrar os núcleos. (Médio

aumento.)

 Histologia aplicada

Muitos  procedimentos  histoquímicos  são  usados  em  diagnóstico  laboratorial  de  várias  doenças.  A  reação  de  Perls

para  ferro,  as  reações  de  PAS-amilase  para  glicogênio  e  Alcian  blue  para  glicosaminoglicanos  são  habitualmente

aplicadas a biopsias de tecidos de pacientes nos quais se quer diagnosticar doenças em que se acumulam nos tecidos

quantidades elevadas de ferro (p. ex., hemocromatose, hemossiderose), glicogênio (glicogenoses), glicosaminoglicanos

(mucopolissacaridoses) e esfingolipídios (esfingolipidoses).

 Detecção de moléculas em cortes histológicos por meio de interações moleculares de alta afinidade

Uma molécula em uma célula ou em um corte de tecido pode ser detectada por meio de compostos

que interagem especificamente e se ligam com a molécula que queremos detectar. Esses compostos

geralmente  não  têm  cor  e,  para  que  possam  ser  vistos,  devem  ser  previamente  acoplados  a  um

marcador

.  Marcador  é  um  composto  visível  por  microscopia  de  luz  ou  eletrônica  e,  quando  está

acoplado  a  uma  substância  com  afinidade  específica  por  uma  molécula,  ela  denuncia  a  presença

dessa  molécula  (Figura  1.19  ).  Os  marcadores  mais  usados  são:  substâncias  fluorescentes  (para

serem  visualizadas  com  um  microscópio  de  fluorescência  ou  de  laser),  átomos  radioativos  (para

serem  detectados  por  radioautografia),  moléculas  de  enzimas  como  a  peroxidase  (que  pode  ser

detectada  pela  demonstração  da  enzima  com  peróxido  de  hidrogênio  e  DAB),  metais  (geralmente

partículas de ouro) que podem ser observados por microscopia de luz e eletrônica. Esses métodos se

destinam principalmente a detectar açúcares, proteínas e ácidos nucleicos.

Faloidina,  proteína  A,  lectinas  e  anticorpos  são  exemplos  de  compostos  que  interagem

especificamente com outras moléculas.

A 

faloidina

, que é extraída de um cogumelo (Amanita phalloides), interage fortemente com actina e é

geralmente marcada com substâncias fluorescentes para demonstrar filamentos de actina .

A 

proteína  A

  é  uma  proteína  extraída  de  Staphylococcus  aureus  e  que  se  liga  à  região  Fc  de

moléculas de imunoglobulinas (anticorpos). Quando a proteína A é ligada a um marcador, podemos

detectar imunoglobulinas em cortes histológicos.

As 

lectinas

 são proteínas  ou glicoproteínas derivadas principalmente de sementes  de vegetais que

se  ligam  com  alta  afinidade  e  especificidade  a  determinados  carboidratos.  Diferentes  lectinas

interagem  com  diferentes  açúcares  ou  sequências  de  açúcares.  Elas,  portanto,  ligam-se  a

glicoproteínas,  proteoglicanos  e  glicolipídios  e  são  muito  usadas  para  caracterizar  moléculas  de

membranas celulares que contêm sequências específicas de açúcares.

Figura 1.19

 Substâncias que têm grande afinidade por uma molécula podem ser marcadas e usadas para identificar esta molécula. A. A molécula a tem uma

afinidade intensa e específica por uma porção da molécula b. B. Se a e b são colocadas em contato, a se liga com a porção de b que ela reconhece. C. Um marcador,

visível em microscopia de luz ou eletrônica, pode ser ligado à molécula a. O marcador pode ser um composto fluorescente, uma enzima como a peroxidase, uma

partícula de ouro ou um átomo radioativo. D. A molécula b pode ser detectada se existir em uma célula ou na matriz extracelular após incubação em uma solução

que contém a molécula a.

 Imunocitoquímica

Um tipo de interação altamente específica entre moléculas é aquela que ocorre entre uma molécula

e  um  anticorpo  que  a  reconhece.  Por  essa  razão,  métodos  que  usam  anticorpos  são  de  grande

utilidade para identificar e localizar proteínas e glicoproteínas. A 

imunocitoquímica

 é a metodologia

que possibilita identificar, por meio de anticorpos, moléculas em cortes ou em células cultivadas.

Em  uma reação  imunocitoquímica,  células em  cultura  ou um  corte  de tecido  que  se supõe  conter

uma  determinada  proteína  são  incubados  em  uma  solução  que  contém  um  anticorpo  que  reconhece

essa  proteína.  Como  o  anticorpo  não  é  visível  por  microscopia,  suas  moléculas  devem  ser

inicialmente  acopladas  a  um  marcador.  O  anticorpo  se  liga  especificamente  à  proteína  e  sua

localização  pode  então  ser  evidenciada  por  microscopia  de  luz  ou  eletrônica,  dependendo  do

marcador que foi acoplado ao anticorpo.

Uma  das  exigências  mais  importantes  da  imunocitoquímica  é  a  disponibilidade  de  um  anticorpo

contra  a  proteína  que  se  pretende  detectar.  Isso  significa  que  a  proteína  deve  ter  sido  previamente

purificada e isolada de modo que anticorpos possam ser produzidos contra ela.

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