Sequenciamento Seus resultados de sequenciamento não estão tão bons quanto você gostaria?



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Sequenciamento



Seus resultados de sequenciamento não estão tão bons quanto você gostaria?

       Os eletroferogramas da sua corrida podem dar várias pistas do que pode ter ocorrido e de como você pode melhorar seus resultados.



Exemplo de um dado analisado de excelente qualidade


Quando você sequencia produtos de PCR, o primeiro passo é obter um ótimo resultado de PCR, otimizando seu protocolo para que sua amplificação seja específica para fragmento de interesse. Produtos de PCR inespecíficos são um dos principais problemas na obtenção um sequenciamento de qualidade.

Além disso, a quantidade de material de partida (DNA molde) para a sua reação de sequenciamento é extremamente crítica para a obtenção de boas sequências. As quantidades variam de acordo com o tamanho dos fragmentos que você pretende sequenciar. A tabela abaixo pode servir como ponto de partida para a otimização da sua reação de sequenciamento.



O sistema Qubit®, da Invitrogen, faz a quantificação do DNA por fluorometria, e é mais indicado que os métodos baseados em absorbância, pois quantifica especificamente o DNA presente na solução.

A purificação, tanto do produto de PCR, quanto da reação de sequenciamento, é fundamental para a obtenção de bons resultados de sequenciamento. Existem diversos Kits para a purificação do produto de PCR, visite o site da Invitrogen e escolha o mais adequado para o seu projeto. A Invitrogen também possui alguns Kits para purificação da reação de sequenciamento (Sequencing Reaction Purification), entretanto o BigDye XTerminator® Purification Kit é um dos protocolos mais rápidos e confiáveis.

Mesmo tomando todos os cuidados acima, ainda podem ocorrer problemas no nosso sequenciamento.

Eletroferogramas mal resolvidos, com muitos picos sobrepostos, podem ser resultado do uso de algorítimos de análise que são inespecíficos para o Kit (dye set) de sequenciamento utilizado. Verifique sempre se o "basecaller" e o "mobility file" estão de acordo com o seu Kit. Se não estiverem, reanalise seus dados utilizando os algorítimos adequados.



No seu programa de análises, verifique sempre a janela EPT para cada eletroferograma. Essa janela mostra o status da corrente, da voltagem, temperatura do forno e potência do laser, que são informações importantes para resolver problemas na sua corrida. Veja abaixo um exemplo de como esses parâmetros devem se corportar durante uma boa corrida.

Oscilações na corrente podem levar a dados incosistentes ou até mesmo falhas na leitura das sequências. Dentre as inúmeras causas para oscilação na corrente, podemos citar: bolhas no bloco ou capilar, erros no preparo do tampão, tampão velho, capilar entupido, decomposição do polímero e a ocorrência de um arco voltáico no equipamento. A figura abaixo mostra um capilar com problemas na corrente (linha verde).




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