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Células-tronco mesênquimais de cães e gatos – uma revisão bibliográfica / (Dogs and cats mesenchymal stem cells – a literature Review)

Resumo
Dentre as células-tronco, as mesênquimais (CTMs) são alvo de muito interesse em pesquisas por não apresentarem barreiras éticas, pela facilidade de obtenção e ainda por serem utilizadas em transplantes autólogos, sendo a medula óssea a maior fonte para utilização. As pesquisas relacionadas à fração de células mononucleares contendo células-tronco têm apontado inúmeras possibilidades para a reparação tecidual e melhoria na qualidade dos processos regenerativos. Inicialmente as CTMs foram isoladas do baço e timo, e subsequentemente, aspirados da medula óssea. Porém, atualmente, essas células vêm sendo isoladas de vários locais do organismo humano e animal, principalmente cães e gatos, incluindo cartilagem, periósteo, sinóvia, líquido sinovial, músculos e tendões. Também são citadas como fonte de CTMs tecidos fetais, placenta, vasos sangüíneos e sangue do cordão umbilical, todavia, apresentam pouca quantidade desse tipo celular comparado com a medula óssea. Em cães e gatos, células-tronco podem ter sucesso de obtenção através da medula óssea obtida na epífise dos ossos longos e nas regiões do íleo, como crista ilíaca ou borda acetabular, cita-se a coleta na crista ilíaca de cães pela facilidade de localização. Essas células em condições adequadas de cultivo exibem morfologia fibroblastóide, adesão em substrato plástico, auto renovação e diferenciação em tipos celulares distintos, incluindo ossos, cartilagem, tecido adiposo, tendões e músculos, após o seu isolamento in vitro. Logo, nota-se que as CTMs possuem potencial reparador e podem ser obtidas, isoladas e expandidas a partir de diferentes formas e condições, devido à diversidade dos protocolos de isolamento e cultura existentes. Essa diversidade traz benefícios relacionados ao desenvolvimento de procedimentos que fornecem alto rendimento e viabilidade das células mesênquimais, aumentando assim o número de células finais transplantadas.
Palavras chave : Animais domésticos | células-tronco | diferenciação celular.
Abstract
Among stem cells, the mesenchymal stem cells (MSCs) are the target of much interest in research because there are no ethical barriers and the ease of obtaining and yet to be used in autologous transplants and the bone marrow is the major source for use. The research related to the stem cells have shown several possibilities for tissue repair and improve the quality of regenerative processes. Initially MSCs were isolated from the spleen and thymus, and subsequently the bone marrow aspirates. However, currently these cells has been isolated from various human body sites and animals, mainly in dogs and cats, including cartilage, periosteum, synovium, synovial fluid, muscles and tendons. Are also cited as source of MSCs the fetal tissue, placenta, blood vessels and umbilical cord blood, however, these sites have little amount of this cell type compared to bone marrow. In dogs and cats, stem cells can be collected through the bone marrow obtained in the epiphysis of long bones and regions of the ileum, as iliac crest or acetabular rim, is cited the attainment in the iliac crest of dogs by ease of location. These cells in appropriate culture exhibit a fibroblastoid morphology, adhesion to plastic substrate, self-renewal and differentiation into distinct cell types, including bone, cartilage, adipose tissue, tendons and muscles, after their isolation in vitro. Therefore, it is noted that MSCs have reparative potential and can be obtained, isolated and expanded from different shapes and conditions because of the diversity of protocols exist for isolation and culture. This diversity brings benefits related to the development of procedures that provide high performance and viability of mesenchymal cells, thus increasing the final number of cells transplanted.
Keywords: domestic animals, stem cells, cell differentiation
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (CTMs)
Considera-se como célula-tronco um tipo especial de célula que apresenta capacidade de se renovar e originar diferentes tipos celulares especializados, não possuindo nenhuma função específica até que essa receba um sinal do ambiente, direcionando-a a diferenciação em uma célula especializada (VALENTINI et al., 2010).

Dentre as células-tronco, as mesênquimais são alvo de muito interesse em pesquisas por não apresentarem barreiras éticas, pela facilidade de obtenção e ainda por serem utilizadas em transplantes autólogos, sendo a medula óssea a maior fonte para utilização (HUANG et al., 2004).

Células-tronco mesenquimais (CTMs) são definidas como células-tronco multipotentes que podem se diferenciar em vários tipos de células in vivo e in vitro em condições controladas (VALENTINI et al., 2010), essas CTMs podem ser isoladas a partir de vários órgãos do organismo, como por exemplo: medula óssea, tecido adiposo, membrana sinovial, músculos, derme, dente decíduo, cordão umbilical, placenta, fígado, baço e timo (MEIRELLES et al., 2006; CAPLAN, 2007). Estas células foram descritas primeiramente por FRIEDENSTEIN e colaboradores em 1975, que descobriu que as CTMs aderem a placas de cultura, assemelham a fibroblastos “in vitro”, e formam colônias.

As CTMs expressam um grande número de moléculas bioativas como moléculas de adesão, proteínas de matriz extracelular, citocinas e receptores de fatores de crescimento, permitindo interações com demais células (HUSS, 2000; BOBIS et al., 2006). Essas moléculas atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (WAN et al., 2008; CAPLAN, 2009).

As pesquisas relacionadas à fração de células mononucleares contendo células-tronco têm apontado inúmeras possibilidades para a reparação tecidual e melhoria na qualidade dos processos regenerativos quando essas são transplantadas em número igual ou superior a 2 x 106 (SUTER et al., 2004). Apesar desse número limitado dessas células na cavidade medular óssea, a proliferação e expansão das mesmas, sob condições adequadas, são facilmente obtidas in vitro (KRAUS e KIRKER-HEAD, 2006). Após a demonstração de que células derivadas da medula óssea apresentam um número de linhagens celulares diferentes, incluindo algumas células responsáveis pela osteocartilogênese, diversos tipos de culturas e manutenção de tais elementos foram descritos (PEREIRA et al., 2008). Esse novo avanço no cultivo de células permitiu a formulação de uma variedade de meios de cultura, acrescidos de substâncias responsáveis pelo melhor desenvolvimento celular in vitro, possibilitando assim o cultivo de células originárias da maioria dos tecidos e órgãos (ASSIS et. al., 2007)

OBTENÇÃO DE CTMs
BITTENCOURT et al. (2006) relatam que a existência de células-tronco não-hematopoiéticas na medula óssea (MO) foi inicialmente sugerida há mais de 130 anos, com estudos de FRIEDENSTEIN et al., (1966) essa teoria foi comprovada.

Inicialmente as CTMs foram isoladas do baço e timo, e subsequentemente, os aspirados da medula óssea. Atualmente, essas células vêm sendo isoladas de vários locais do organismo humano e animal, incluindo cartilagem, periósteo, sinóvia, líquido sinovial, músculos e tendões (FRIEDENSTEIN et. al., 1966). Também são citadas como fonte de CTMs tecidos fetais, placenta, vasos sangüíneos e sangue do cordão umbilical (HU et. al., 2003), todavia, apresentam pouca quantidade desse tipo celular comparado com a MO.

Segundo MEIRELLES et al., (2006) as células-tronco mesênquimais já foram obtidas de diversas espécies de animais, tais como, humanos, ratos, camundongos, cão, coelho, porco, cabras, ovinos e babulínos. Essas CTMs podem ser isoladas a partir de vários órgãos do organismo, como por exemplo: medula óssea, tecido adiposo, membrana sinovial, músculos, derme, dente decíduo, cordão umbilical e veias do cordão (ZUCCONI et al., 2010), placenta, fígado, baço e timo (MEIRELLES et al., 2006; CAPLAN, 2007).

Pesquisas sobre o desenvolvimento das membranas fetais de cães (WENCESLAU et al., 2010; MARTINS, et al., 2011) e gatos pareceram apropriadas, uma vez que estas visam o estabelecimento de culturas de células-tronco do âmnio ou a extração de hemangioblastos (MIGLINO et al., 2006;).

Historicamente, o cão tem sido um modelo útil para estudar mecanismos e testar novas terapias de várias patologias humana (ZUCCONI et al., 2010).

Em cães e gatos, células-tronco podem ter sucesso de obtenção através da medula óssea pode obtida na epífise dos ossos longos e nas regiões do íleo, como crista ilíaca ou borda acetabular (SLATTER, 1998), cita-se a coleta na crista ilíaca de cães pela facilidade de localização. Diversos autores utilizaram a referida via de acesso para coleta de medula óssea, tanto para obtenção de células mononucleares, quanto para aquisição de células medulares, em exames cito-histopatológicos (SAMOTO, 2006; ZAMPROGNO, 2007). Contudo, em cães de pequeno porte ou gatos, a coleta de amostras medulares é facilitada na região trans-ilíaca ou porção proximal do fêmur. Punções trans-ilíacas reduzem o risco de lesões provocadas pelo deslizamento acidental da agulha pela crista ilíaca (SLATTER, 1998). Para cães obesos ou musculosos, a porção crânio-lateral da tuberosidade maior do úmero é uma ótima opção para coleta de material (SLATTER, 1998; ZAMPROGNO, 2007).

Para o procedimento de coleta e obtenção de células progenitoras da MO de cães, o animal deverá ser submetido à anestesia geral e posicionado conforme o local escolhido para a coleta. Sugere-se o decúbito lateral (ZAMPROGNO, 2007) se a coleta da medula óssea for realizada no osso femoral ou tibial, e o decúbito ventral se a escolha for a crista ilíaca (TOGNOLI et al., 2009). Entretanto, na prática dos autores, o posicionamento melhor é o decúbito lateral onde é possível acessar todos os locais anatômicos sugeridos anteriormente.
CULTIVO DE CTMs
O cultivo de CTMs é feito selecionando-se as células com propriedade de adesão ao plástico, sendo que as células que permanecem em suspensão são facilmente removidas. Os outros tipos celulares “contaminantes” como os macrófagos, são eliminados após um determinado número de passagens em cultura (JAVAZON et. al., 2004).

Em culturas e em condições adequadas de cultivo, as CTMs exibem morfologia fibroblastóide, adesão em substrato plástico, auto renovação e diferenciação em tipos celulares distintos, incluindo ossos, cartilagem, tecido adiposo, tendões e músculos (MENDELOW et al., 1980; PITTENGER et al., 1999; POUNTOS e GIANNOUDIS, 2005; NARDI e MEIRELLES, 2006). Podem ser expandidas por mais de 40 gerações mantendo capacidade multipotente, embora reduzam as taxas de mitose e haja uma grande probabilidade de acúmulo de mutações, tornando desaconselhável seu uso clínico, nestas condições (DEANS e MOSELEY, 2000).

Outra característica das CTMs é que quando cultivadas em baixa densidade a adesão e a formação de colônias é rápida, onde se presume que estas colônias sejam derivadas de uma única célula precursora (DEANS e MOSELEY, 2000).

Depois de anos de investigação sobre a composição dos meios, a seleção deste ainda permanece empírica (REINA, 2003). Alguns meios de cultivo disponíveis comercialmente estão listados no quadro 1, e outros já são recomendados na literatura de acordo com espécie em questão (Quadro 2).




QUADRO 1 – Principais meios disponíveis no mercado para cultivo de células-tronco mesênquimais.

NOME COMERCIAL


DESCRIÇÃO


Meio Basal de Eagle (BME)

Meio contendo apenas aminoácidos essenciais. Necessita ser suplementado com soro fetal bovino a 10%.


Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM)

Contém mais aminoácidos e em maior concentração que o BME. Requer suplementação com SFB.




Meio MEM modificado por Dulbecco

(DMEM)

Contém quatro vezes a concentração de aminoácidos e vitaminas que o BME.




Meio DMEM modificado por Iscove

(IMDM)

Meio completo que inclui na formulação albumina bovina, transferrina, selênio, e outros. Requer suplementação com SFB.





Meio F-10 de Ham

Meio que pode ser suplementado com proteínas e hormônios. Contém metais como o ferro, cobre e zinco.





Meio F-12 de Ham

Fornece suplementação protéica as células. Pode ter seu uso combinado ao IMDM




Fonte: REINA, 2003

QUADRO 2 – Protocolos de cultura de células-tronco mesenquimais nas diferentes espécies.

AUTORES


ESPÉCIE

FONTE

PROTOCOLOS




BRUDER et al.,

1998

Canina

MO


- Coleta de 9mL MO diluída em 1mL solução salina heparinizada (1000U/mL).

- Adição de DMEM (2:1) suplementado com SFB 10%, penicilina G (100U/mL), estreptomicina (0,1mg/mL), anfotericina B (0,25μg/mL).

- Separação por gradiente percoll (1,073g/mL), lavadas e plaqueadas 107 células/frasco.

- Incubadas em estufa 5% CO2 a 37ºC

- Troca do meio realizado no 4º dia do cultivo, e após duas vezes por semana. Passagens realizadas no 9º, 10º e 11º dias de cultivo, por replaqueamento de 8 x 103 células/cm2.

- Total de 3 x 107 células transplantadas.





HUANG et al.,

2004

Humanos


MO
TA

- Coleta 5 – 8mL MO diluída em heparina (100U).

- Adição de DMEM suplementado com SFB 10%, produzindo a suspensão celular por centrifugação.

- Resuspenso em 5mL de DMEM e SFB 10%.

- Separação por gradiente percoll (70% de densidade inicial).

- TA foi macerado e lavado duas vezes em PBS.

- Digestão enzimática com colagenase 0,075% e centrifugação para a obtenção da suspensão celular.

- Plaqueadas 1 x 106 células/frasco.

- Ambas cultivadas em monocamadas na estufa 5% CO2 a 37ºC, até atingir confluência de 80%,

- Remoção das células aderentes com tripsina

0,25%



IM et al., 2001

Coelhos

MO

- Amostra de 2mL MO diluída em 0,1mL heparina (3000UI).

- Separação por gradiente ficoll (0,7mL), 200g por 15 minutos.

- Lavagens tripla em meio Ham F-12 200g por 5 minutos.

- Cultivo em meio Ham F-12 suplementados com SFB 10%, penicilina G (100U/mL), estreptomicina (0,1mg/mL), anfotericina B (0,25μg/mL), estufa 5% CO2 em frascos de cultura de 25 cm2.

- Meio trocado a partir do 3º dia, e após todos os dias até o 20ºdia.

- Remoção das células aderentes com tripsina 0,25% e 0,001M EDTA, 3 lavagens em meio Ham F-12 e contagem das células em hemocitômetro.

- O número médio de células foi de 3,4 (±1,5)x

106 antes e 2,3 (±0,6)x106 após a cultura.




MO – Medula óssea, TA – Tecido adiposo, SFB – Soro fetal bovino, PBS – solução salina tamponada

IDENTIFICAÇÃO DE CTMs
A microscopia de luz mostra que as células tronco mesenquimais possuem formato fibroblastóides alongados, fusiformes e potiagudas, com núcleos eucromáticos, ovais, grandes e centrais e com citoplasma abundante (RINGE et al., 2002; COLLEONI et al., 2005; TAGAMI et al., 2003).

Todas as células do organismo apresentam um conjunto de marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os contêm. Essa imunofenotipagem é realizada com a utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem esses antígenos de superfície da membrana celular, conforme demonstrado em estudos contemporâneos (MEIRELLES et al., 2006).

Como proposto pelo comitê de células-tronco mesênquima da Sociedade Internacional de Terapia Celular, as células-tronco mesênquimais humanas são definidas como CD105, CD73 e CD90 positivos (expressão em torno de 90%) e negativas para CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a, ou CD19 e HLA. O marcador de superfície celular STRO-1 é considerado o melhor marcador para células-tronco mesênquimais, porém não é exclusiva para esse tipo celular ainda, sua expressão não é mantido durante sucessivas passagens em cultivo (KOLF et al., 2007; LACONO et al. 2010).

Embora já tenham sido identificados oito marcadores de superfície para identificação de CTMs, a International Society for Cellular Therapy concorda que apenas a identificação dos marcadores CD105, CD73 e CD90, quando não estiverem expressos marcadores hematopoiéticos, é suficiente para a imunofenotipagem dessas células. Contudo, essa caracterização deve sempre estar acompanhada da demonstração da aderência celular por longos períodos em cultura e da diferenciação destas em pelo menos duas linhagens celulares distintas (HORWITZ et al.,2005).


DIFERENCIAÇÃO IINDUZIDA DE CTMs
Após o seu isolamento in vitro, as células tronco mesênquimais mostram uma capacidade de diferenciação em várias linhagens mesênquimais (Tabela 1) (LEE et al., 2010) e em vários tecidos quando induzidas após a utilização de culturas adequadas. As CTMs podem se diferenciar em osteoblastos, adipócitos, condrócitos (RINGE et al., 2002; KUMAR et al., 2007), tenócitos, células musculares, cardiomiócitos e células do estroma de sustentação da hematopoiese, (PITTENGER et al., 1999; CAPLAN ,2005). Sua plasticidade, No entanto, não se limita aos derivados mesenquimais. Relatórios sugerem que as CTMs podem se diferenciar em neurônios (MOORMAN et al., 1999; KOHYAMA et al., 2001).

As CTMs demonstram resultados promissores em estudos pré-clínicos e clínicos, em doenças cardíacas, pulmonares, traumas medulares e no sistema nervoso central e em defeitos ósseos cartilaginosos (BEYER et al., 2006; LE BLANC, 2006).

A bioengenharia tecidual em associação a biomateriais tem demonstrado resultados satisfatórios com utilização de células tronco mesenquimais (ZHANG et al., 2007).

Autores como SCHAUWER e SOOM (2011) relatam que a expansão de células-tronco mesenquimais (CTM) de diferentes origens (celulas de medula ossea, sangue periférico, anexos embrionários, entre outros), tem sido muito estudada pelo fato de se diferenciarem em varias linhagens, e representam uma população promissora para as terapias celulares com base em medicina veterinária. Há ainda poucas informações sobre as origens das CTMs, uma teoria é a origem neuroectodermal, a partir de células neuroepiteliais SOX1 (TAKASHIMA et al., 2007).

Outro mecanismo de diferenciação celular proposto é a fusão, onde se acredita que as CTMs podem fusionar-se a uma célula adulta-alvo, assumindo o padrão de expressão gênica da célula adulta a qual se uniu. A fusão celular é um fenômeno biológico amplamente conhecido, ocorrendo principalmente nas células cuja poliploidia (dois ou mais conjuntos de cromossomos) é comumente vista, como em hepatócitos e células musculares esqueléticas (HERZOG et al., 2003; MEIRELLES et al., 2006).

Além disso, as CTMs secretam uma grande variedade de quimiocinas, além de expressar receptores para citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, as CTMs interagem com as células residentes (nicho) e podem induzi-las, por mecanismo parácrino, a se diferenciar em linhagens celulares distintas, de acordo com essa sinalização (TAKASHIMA et al., 2007).

Tabela 1 - Origem e tipos celulares derivadas das células-tronco mesênquimais (Fonte: Adpt de POUNTOS e GIANNOUDIS, 2005)


ISOLAMENTO



CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

DIFERENCIAÇÃO

MEDULA ÓSSEA

OSTEOBLASTOS

OSSO TRABECULAR

CONDRÓCITOS

PERÓSTEO

ADIPÓCITOS

CARTILAGEM ARTICULAR

MIÓCITOS CARDÍACOS

SINÓVIA

FIBROBLASTOS

LIQUIDO SINOVIAL

MIOFIBROBLASTOS

MÚSCULOS

MIÓCITOS ESQUELÉTICOS

TECIDO ADIPOSO

TENÓCITOS

TENDÕES

CÉLULAS DA RETINA

SANGUE

CÉLULAS NEURAIS

VASOS SANGUÍNEOS

ASTRÓCITOS

CORDÃO UMBILICAL

HEPATÓCITOS

PELE

ESTROMA DE SUPORTE

BAÇO E TIMO

CÉLULAS PANCREÁTICAS


ISOLAMENTO CELULAR
Em testes de histocompatibilidade, imunoensaios celulares in vitro, protocolos de cultivo celular e outros procedimentos em geral, têm sido utilizados diversos gradientes de densidade de alto peso molecular. Dentre eles estão o Ficoll-Hypaque®, Histopaque®, Isolymph® e Nycomed®, os quais apresentam a função de isolar linfócitos e células mononucleares do sangue periférico e da medula óssea (ISLAM, 1994).

As principais soluções para a diluição da MO são: solução salina tamponada (PBS) (OLIVEIRA, 2009) e meios de cultivo modificados, podendo este último ser suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 10% (BITTENCOURT et al., 2006).

Existem diversos protocolos de isolamento recomendados pela literatura. Esses dados foram compilados em uma tabela (Tabela 2).


Tabela 2 – Protocolos de isolamento celular e fonte de obtenção das CTMs.


AUTORES


ESPÉCIE

FONTE

PROTOCOLOS



OLIVEIRA, 2009

Coelhos

Medula

Óssea



- Colheita de 2mL de MO diluído em 0,1mL

de solução fisiológica heparinizada (5000UI),

diluído em PBS (1:1).

- Centrifugação em gradiente Ficoll

1,077g/mL (diluição 2:1) a 495g, durante 30

min a 15ºC.

- Lavagens com PBS e DMEM baixa glucose suplementado com soro fetal bovino 10%,

493g durante 10 minutos a 4ºC.

- Rendimento: 6,25 x 106 células/mL




OLSSON et al., 2009

Canina

Medula

Óssea



- Colheita de 10ml/kg MO em bolsas de coleta contendo 0,1mL de heparina (10000UI).

- Centrifugação a 440g, na diluição 1:1 com gradiente Histopaque 1,077g/mL, temperatura entre 18-26ºC.

- Lavagens celulares com solução salina 0,9%, DMEM e soro sanguíneo autólogo estéril, a 440g durante 5 minutos.

- Rendimento: 2,57 x 106 células/mL




PEREIRA et al., 2008

Coelhos

Tecido


Adiposo

- Gordura subcutânea fragmentada e lavada

com PBS 2%.

- Digestão enzimática com colagenase (2mg/mL), DMEM, BSA (20mg/mL) penicilina e estreptomicina, durante 50 minutos a 37ºC.

- Bloqueio enzimático com SFB

- Pellet diluído em DMEM e SFB a 10%





BITTENCOURT et al.,2006

Ratos


Medula


Óssea

- Lavagem para colheita da MO com 10mL de meio Knockout DMEM e DMEM-alta concentração de glucose.

- Centrifugação a 1200rpm por 10 minutos.

- Rendimento: 6 x 106 células/mL





CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nesta revisão nota-se que as células-tronco mesênquimais (CTMs) possuem potencial reparador e podem ser obtidas, isoladas e expandidas a partir de diferentes formas e condições, devido à diversidade dos protocolos de isolamento e cultura existentes. Essa diversidade traz benefícios relacionados ao desenvolvimento de procedimentos que forneçam alto rendimento e viabilidade das células mesênquimais, aumentando assim o número de células finais transplantadas.

A medula óssea é uma fonte autóloga facilmente acessível de obtenção desse material e pode ser adquirida do interior dos ossos longos, como trocanter maior do fêmur e tuberosidade maior do úmero, e os avanços nas pesquisas com células-tronco mesênquimais (CTMs) da medula óssea, em cães e gatos, desperta a necessidade de aumentar os conhecimentos básicos a respeito de sua origem, sua aquisição e seu processamento.



REFERENCIAS
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