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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DEPARTAMENTO DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq.
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período:02/08/2015 a 10/08/2015.

( ) PARCIAL

(x) FINAL


IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa:

Estudo fitoquímico e avaliação do perfil de espécies vegetais usadas tradicionalmente na medicina popular da região amazônica.



Nome do Orientador: Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Química

Unidade: Instituto de Ciências Exatas e Naturais

Laboratório: Laboratório de Cromatografia Líquida – LABCROL–

Título do Plano de Trabalho:

Estudo fitoquímico da espécie vegetal Physalis angulata L.



Nome do Bolsista: Luziane da Cunha Borges

Tipo de Bolsa:

(x) PIBIC/CNPq




  1. RESUMO

No Pará encontram-se diversas espécies vegetais usadas popularmente para fins terapêuticos. Dentre essas espécies encontra-se Physalis angulata Lin. (Família Solanaceae) que é uma planta considerada daninha conhecida popularmente como camapú, dispersa em vários estados do Brasil e em vários continentes, esta espécie é amplamente utilizada na medicina popular devido possuir metabolitos secundários, os quais apresentam propriedades anticoagulante, antileucêmica, anti-inflamatória, anticâncer, analgésica e entre outras. Por esta razão, este trabalho buscou realizar o estudo fitoquímico do extrato etanólico de todas as partes da planta. Foi realizada a análise do perfil cromatográfico do extrato por HPLC em seguida o mesmo foi fracionado por cromatografia em coluna e as frações resultantes foram analisadas por cromatografia clássica e por HPLC, resultando no isolamento de duas substâncias, fisalina D (S2) e fisalina G (S1). As substâncias isoladas são pertencentes à classe dos vitaesteróides, sendo suas estruturas posteriormente elucidadas através de técnicas espectroscópicas uni e bidimensionais de RMN.


Palavras-chave: Physalis angulata Lin., camapú e HPLC.


  1. INTRODUÇÃO

As plantas são fontes indispensáveis da medicina popular desde tempos imemoriais. O uso de plantas para fins medicinais são considerados como as primeiras formas de uso de medicamentos que se tem conhecimento (MOTA,2004). Registros apontam que o uso de plantas medicinais já era evidenciado há 60.000 anos tanto na cultura ocidental como na oriental, como também em países desenvolvidos e não desenvolvidos.

De maneira indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem os conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora mundial (MACIEL et al., 2002).

Ao levar em consideração a enorme biodiversidade brasileira, especialmente da região amazônica, a descoberta de novas classes de compostos e substâncias bioativas para finalidades terapêuticas se torna cada vez mais possível.

A fitoterapia tem assumido um expressivo papel no contexto da medicina. A cada ano vem crescendo o número de profissionais e pacientes que procuram este recurso para solucionar questões relacionadas à saúde (FERRO et al., 2008). Sendo assim, o estudo químico relacionado às plantas com atividades medicinais resulta de um grupo de pesquisa multidisciplinar, no qual fitoquímicos, botânicos, farmacologistas e microbiologistas corroboram na tentativa de validar as plantas medicinais, visando obter novos agentes químicos (BRESOLIN et al., 2003).

As plantas da família Solanaceae ocorrem em diversas partes do mundo e tem como centro de diversidade a América do Sul. No Brasil, ocorrem 31 gêneros e cerca de 500 espécies nativas (HUNZIKER, 2001). Destes, 23 gêneros e aproximadamente 180 espécies nativas (STEHMANN & MENTZ, 2006) fazem parte da flora da região sul do Brasil. No Rio Grande do Sul, a família está representada por 22 gêneros, com representantes nativos e seis gêneros com representantes introduzidos, compreendendo 115 e 26 espécies, respectivamente (MENTZ et al., 2007, SOARES et al., 2007b).

O táxon Physalis abrange cerca de cento e vinte (120) espécies com caracteres principalmente herbáceos, que se distribuem pelas zonas temperadas do globo terrestre, especialmente nas Américas do Norte e do Sul, cujos principais centros de diversidade taxonômica encontram-se nos Estados Unidos e México (HAWKES et al., 1991; TOMASSINI et al., 2000).

O nome Physalis origina-se do grego, onde “physa” significa bolha ou bexiga, referindo-se ao cálice que envolve os frutos, principal característica das plantas que compõem este táxon (HAWKES et al., 1991).

A espécie P. angulata é exclusivamente produtora de seco-esteróides C/D altamente oxigenados, chamadas fisalinas. Estudos anteriores levaram ao isolamento de derivados de vitanolídeos tripanocidas. Os vitanolídeos são esteróides estruturalmente diferentes com um esqueleto de ergostano em que C-22 e C-26 são oxidados para formar uma -lactona. Estes compostos são específicos para a família Solanaceae e, em particular, para os gêneros Withania, Acnistus, Dunalia, Physalis, Datura, Lycium, e Jaborosa (SILVA et al., 2005).

Das cento e vinte espécies de Physalis existentes é possível encontrar na literatura a identificação de dezenove fisalinas principais, e de algumas destas, seus isômeros. É interessante notar a pluralidade de anéis que este grupo de vitaesteróides apresenta. Dessas dezenove já elucidadas, cinco são heptacíclicas, oito octacíclicas, cinco nonacíclicas e uma undecacíclica.




  1. JUSTIFICATIVA

Nos últimos anos, o uso de produtos à base de planta tem vindo a aumentar nos países em desenvolvimento. As plantas tem sido sempre uma fonte atraente de drogas. Por outro lado as formas de interações moleculares e mecanismos de bioatividade dos extratos ou os seus componentes bioativos proporcionam um desafio para os cientistas (HEMAMALINI et al., 2013).

Os produtos de origem vegetal, denominados fitoterápicos, estão relacionados com a exploração tecnológica e econômica de vegetais empregados na prevenção, no tratamento e na cura de distúrbios, disfunções ou doenças. Estes produtos necessitam de um controle de qualidade adequado, tanto para suas matérias primas (plantas), quanto para o produto tecnologicamente acabado (fármaco). Este controle contribui, sem dúvida, para o tripé eficácia, segurança e qualidade, refletindo como principal resultado no binômio custo-benefício. Estes princípios são necessários ao desenvolvimento cientifico e tecnológico dos medicamentos fitoterápicos, pois asseguram uma melhor aceitação pela classe médica que os prescreve, propiciando confiabilidade àqueles que os venham consumir.

Physalis angulata Lin., (sinonímia: Physalis dúbia Link, Physalis linkiana Nees. Physalis ciliata Sieb. et Zucc.) é popularmente conhecida como camapum, palavra de origem tupi que significa “estalo do peito” em virtude do som reproduzido quando estalado contra o peito. Por ser uma planta amplamente dispersa em vários estados do Brasil, também é conhecida por outras denominações como, bucho-de-rã, joá-de-capote, camapú, camambú, camarú, mata-fome, bate-testa, joá, juá-poca, balão-rajado e balão (LORENZI, 2002).

P. angulata Lin. é, sem dúvida, a mais representativa das espécies do gênero Physalis, considerando seu valor medicinal. Integra o elenco de plantas curativas de diversos sistemas de medicina tradicional de várias partes do planeta, inclusive do Brasil, cujas propriedades medicinais são amplamente difundidas, especialmente no Nordeste do Brasil e Amazônia. O chá da planta é recomendado na forma de banho para o tratamento de reumatismo e males do fígado. Seus frutos são utilizados como desobstruentes e diuréticos. As folhas são aplicadas contra inflamação da bexiga, do baço e contra icterícia. Sendo ainda empregadas no tratamento de malária e hepatite. O suco é considerado calmante e depurativo, sendo empregado contra dores de ouvido. Algumas tribos indígenas colombianas consideram as folhas e frutos com propriedades narcóticas, e em uso externo, o decocto destas partes é utilizado como anti-inflamatório para doenças de pele em geral. No sistema de medicina tradicional do Peru, as raízes deixadas em repouso no rum são empregadas no tratamento de diabetes (LORENZI, 2002).

De acordo com a literatura diversas atividades na espécie Physalis angulata Lin. já foram estudadas e comprovadas. Na medicina popular, os extratos ou infusos da planta tem sido utilizado em vários países para o tratamento de diversas doenças, como malária, asma, hepatite, dermatite e reumatismo (LIN et al., 1992).



A partir destas considerações e diante da importância da pesquisa química de produtos naturais para a obtenção de novos compostos com finalidade terapêutica, este trabalho vem avaliar o perfil químico do extrato etanólico de P. angulata Lin. buscando isolar e identificar as substâncias presentes no extrato.



  1. OBJETIVOS




    1. GERAL




  • Estudar o perfil químico do extrato etanólico da espécie Physalis angulata L. (camapú) por HPLC e fornecer base para a produção de fitoterápicos.




    1. ESPECÍFICOS




  • Estudar quimicamente o extrato etanólico de Physalis angulata, visando isolar os principais constituintes químicos, utilizando a técnicas cromatográficas;

  • Identificar as estruturas isoladas utilizando técnicas espectrométricas de RMN (uni e bidimensionais);



  1. PARTE EXPERIMENTAL




    1. MATERIAIS E MÉTODOS




  • Nas separações cromatográficas em coluna, foi utilizada como adsorvente sílica gel (60-200 µm) da SilicaFlash®G60.

  • Solvente grau HPLC: acetonitrila. A água foi purificada em um sistema de água Millipore e as fases móveis foram passadas em um filtro de membrana de nylon com poros de 0,45 µm.

  • Solventes grau PA: Hexano, Acetato de etila, Metanol e Álcool etílico.

  • Foi utilizado como revelador nas cromatoplacas: ácido sulfúrico (revelou as substâncias exibindo coloração).

  • As amostras foram pesadas em balança analítica SHIMADZU, modelo AY220, com precisão de 0,0001 g.

    • Técnica Cromatográfica: Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) em cromatoplacas medindo 5x5 cm.




    1. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS UTILIZADOS




  • Evaporador rotativo a vácuo QUIMIS, modelo Q-344-2, para concentração da solução etanólica;

  • Para o tratamento das amostras (clean up) foram utilizados cartuchos com fase estacionária C18, todos da Phenomenex.

  • Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência da marca Shimadzu, modelo PROMINENCE, composto por duas bombas modelo LC-10 AD de um canal, detector de arranjo de diodo modelo SPD-M20A, degaseificador de membrana modelo DGU-14A, auto-injetor de amostras modelo SIL-20A, interface de comunicação modelo CBM-20A acoplado a um microcomputador Pentium IV com software de integração LCsolution;

  • Em cromatografia líquida de alta eficiência utilizou-se como fase estacionária uma coluna Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, 110 Å) analítica. A coluna de segurança ou pré-coluna foi um HOLDER® bicompartilhado contendo, em seu interior, um cartucho de segurança C18 (4 x 30 mm, 5 µm), adquirido da Phenomenex® (Torrance, CA, USA);

  • Para validação do método foi utilizada como fase estacionária uma coluna Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, 110 Å), analítica;

  • Seringas descartáveis de 5 mL; filtro de seringa de nylon de 13 mm, com poro de 0,45 µm (Tedia Brasil); pipetas calibradas da Labmate de 1 a 5 mL e 100 a 1000 µL; ponteiras de 300 µL, 1 mL e 5 mL;

  • Ultrassom da Branson 2510.

  • Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência da marca Shimadzu, modelo PROMINENCE, composto por duas bombas modelo LC-6 AD de um canal, detector de arranjo de diodo modelo SPD-10AV, degaseificador de membrana modelo DGU-2A5R, auto-injetor de amostras modelo LC-8A, interface de comunicação modelo CBM-20A acoplado a um microcomputador Pentium IV com software de integração LCsolution;




    1. COLETA DO MATERIAL VEGETAL PARA ANÁLISE FITOQUÍMICA

Espécies de Physalis angulata Lin. foram coletados no município de Boa Vista do Acará, no estado do Pará. A planta foi identificada taxonomicamente pelo Dr. Ricardo Secco, do departamento de Botânica. Os espécimes foram depositados no herbário do Museu de Emilio Goeldi (Pará, Brasil).




    1. OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO

O material botânico de Physalis angulata L. foi seco em estufa com temperatura máxima de 40ºC, em um período de sete dias, sendo posteriormente trituradas em moinho de facas, obtendo-se um total de material seco e moído de 500 g. Este material foi submetido a cinco extrações (com 100g cada extração) a quente por Sohxlet com solvente etanol grau PA em um tempo de 5 dias por 7 horas cada. O solvente foi eliminado em evaporador rotativo sob pressão reduzida obtendo o extrato etanólico bruto (50 g).



    1. FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO ETANÓLICO DE P. angulata Lin.

O extrato etanólico bruto (50 g) foi fracionado por CCVU - Coluna Cromatográfica por Via Úmida filtrante, utilizando-se misturas de solventes com polaridade crescente, em um volume calculado de 550 mL de cada sistema: Hexano/Acetato de etila (1:9; 3:7; 1:1), Acetato de etila 100%, Acetato de etila/ Metanol (2:8) e Metanol 100%, obtendo-se após a evaporação dos solventes as respectivas frações F1 (2,25 g); F2 (1,94 g); F3 (826,7 mg) e F4 (4,25 g); F5 (16,6 g) e F6 (8,07 g) (FLUXOGRAMA 1), obtendo um rendimento de aproximadamente 67,9%.

Analisando as três últimas frações no HPLC numa eluição em gradiente, obteve-se os cromatogramas, como resultados, estes mostraram que a fração F4 (Acetato de etila 100 %), mostrou ser promissora por apresentar as substâncias de interesse.

Como o objetivo do trabalho é isolar substâncias presentes no extrato e foi constatado que as mesmas encontram-se na fração F4, julgou-se necessário então refraciona-la.

A fração F4 (4,25 g) foi refracionada por Cromatografia em Coluna (FLUXOGRAMA 1), utilizando-se misturas de solventes com polaridade crescente, em um volume calculado de 500 mL de cada sistema: Hexano/Acetato de etila/Metanol (50:47,5:2,5; 50:45:5; 50:40:10; 30:60:10), Acetato de etila/Metanol (90:10) e Metanol 100%. Foram obtidas 78 frações, as quais foram analisadas por CCDC (Cromatografia em Camada Delgada Comparativa) e a partir dos resultados algumas frações foram reunidas, foi observado que alguns compostos de interesse encontravam-se na reunião 39-41 (169,9 mg), na fração 43 (30 mg) e na fração 49 (20,1 mg) que provavelmente apresentou uma substância isolada de acordo com analises por HPLC.


    1. PRÉ-TRATAMENTO UTILIZADO PARA OBTER O PERFIL CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO E DAS FRAÇÕES DA CCVU.

O método de pré-tratamento (clean up) empregado foi a Extração em Fase Sólida (SPE). Foram utilizados cartuchos Strata-C18 da Phenomenex, com 50 g de fase estacionária e 1,0 mL de volume. Foi usada uma alíquota de 10 miligramas do extrato e em seguida 10 miligramas da reunião 39-41, da fração 43 e da fração 49. O cartucho Strata-C18 foi condicionado com 1,0 mL de acetonitrila e em seguida 1,0 mL de H2O. À alíquota de cada fração, foi adicionado 0,8 mL de acetonitrila e levado ao ultrassom por um minuto. Após esse tempo, foi adicionado 0,2 mL de H2O e levado ao ultrassom por mais um minuto. A solução foi aplicada no cartucho, recolhendo-se a solução de interesse e em seguida passou-se mais um volume do sistema (1,0 mL de Acetonitrila/Água 8:2 v/v) e coletado no mesmo recipiente. O solvente foi evaporado na capela e ressuspendido em 1 mL de acetonitrila, de onde se retirou uma alíquota de 20 µL da solução resultante, sendo injetado no cromatógrafo líquido.

Com o objetivo de se obter o perfil cromatográfico do extrato, uma alíquota de 20 µL da solução obtida após a suspenção de 1 mL de Acetonitrila obtida do pré- tratamento, foi injetada no HPLC em uma eluição em gradiente com fase móvel composta por solvente A = Água e B = Acetonitrila, variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico (B), no tempo de 60 minutos de análise. A vazão da fase móvel foi de 1 mL/minuto, e o detector de absorbância na região do ultravioleta operando em 227 nm, para a análise do melhor sistema a ser utilizado na separação.

Como fase estacionária, utilizou-se uma coluna analítica Gemini C18 (250 x 4,6 mm), com partículas de 5 µm, dotada de pré-coluna. Como fase móvel utilizou-se uma mistura de solventes composta por água ultrapura e acetonitrila (ACN) grau HPLC. Os solventes foram filtrados em membrana de nylon de 0,45 µm.

Com o objetivo de otimizar o método para o isolamento das substâncias de interesse, realizou-se o perfil cromatográfico das frações Fr.39-41 e Fr.49 do refracionamento da fração F4 (Acetato de etila 100%), relatado anteriormente, para prever se havia possibilidade de eluição no modo isocrático. Baseado na relação (Trz - Tra) /Tg, que deve apresentar valor inferior a 0,4 segundo SNYDER e colaboradores (1997), foram realizados o cálculo e o resultado obtido para a relação foi inferior a este valor, para as frações analisadas, demonstrando que a separação podia ser realizada no modo isocrático.

Considerando o estudo de SNYDER e colaboradores (1997), é possível propor valores desejáveis para o fator de retenção k (k = 5; k = 10; k = 20), com base nos tempos de retenção da última banda. O tempo de retenção para a reunião 39-41 foram próximos a 27 minutos. Com isso, foi calculado um valor teórico para o percentual do modificador orgânico baseado nos estudos de SNYDER. Para se estimar um valor de percentual do modificador orgânico, optou-se por uma separação com k = 10 e foi sugerido um sistema isocrático. Os sistemas propostos por SNYDER, entretanto, não foram eficientes, uma vez que não foi observado uma boa seletividade entre os compostos, havendo a necessidade de uma otimização. Com isso foi escolhido o seguinte sistemas: 36% (Fração 39-41). A análise em um sistema no modo isocrático ainda não foi realizada para a fração 49 já que a mesma possui uma substância isolada de acordo com analises espectrométricas de RMN.



FLUXOGRAMA 1. Obtenção do extrato, das frações e substâncias obtidas (até o momento) a partir do material botânico de P. angulata Lin.


Extração por Sohxlet com Etanol grau PA

CCVU Filtrante

Fisalina G Fisalina D

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