ANÁlise de ensaios in vitro do compósito de 50%ha-50%TiO



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ANÁLISE DE ENSAIOS IN VITRO DO COMPÓSITO DE 50%HA-50%TiO2 FABRICADOS PELO MÉTODO DA ESPONJA POLIMÉRICA
A. G. S. Galdino1, E. M. Oliveira2, F. B. Filippin-Monteiro2, C. A. C. Zavaglia3

1Instituto Federal de Ensino, Pesquisa e Extensão do Espírito Santo, São Mateus (ES), Brasil

2Faculdade de Ciências Farmacêuticas / Universidade Estadual de São Paulo, São Paulo (SP), Brasil

3Faculdade de Engenharia Mecânica / Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP), Brasil

E-mail: andregsg@ifes.edu.br



À medida que há uma melhoria na tecnologia aplicada à saúde humana, a expectativa de vida vem aumentando, mas nem todas as partes do corpo podem manter suas funções com o processo de envelhecimento. A engenharia tecidual foi desenvolvida para substituir, reparar ou reconstruir tecidos ou órgãos perdidos ou danificados por acidentes ou doenças graves através da utilização e desenvolvimento de novos materiais, que sejam biocompatíveis, bioabsorvíveis, porosos, entre outras características. O objetivo deste trabalho é avaliar os ensaios in vitro do compósito poroso de hidroxiapatita – titânia (HA-TiO2), com composição de 50% HA – 50% TiO2 para obter arcabouços utilizados para engenharia tecidual óssea. Os corpos de prova foram produzidos pelo método da esponja polimérica, utilizando bicarbonato de sódio como ligante e floculante. A sinterização foi realizada em três temperaturas: a 1250ºC; 1300ºC e 1350ºC. Linhagens imortalizadas de fibroblastos e osteoblastos foram utilizadas para avaliar o compósito frente à citotoxicidade, crescimento e adesão celular. Nesses ensaios foram utilizados três corpos de prova porosos em um intervalo de cinco dias. Os resultados obtidos mostraram-se satisfatórios, com adesão e crescimento das células de fibroblastos e osteoblastos, o que serve como indicador para que esse compósito seja submetido posteriormente a ensaios in vivo.
Palavras-chave: Hidroxiapatita, Titânia, Engenharia Tecidual Óssea, Ensaios in vitro, Método da esponja polimérica
1. INTRODUÇÃO
À medida que há uma melhoria na tecnologia aplicada à saúde humana, a expectativa de vida vem aumentando, mas nem todas as partes do corpo podem manter suas funções com o processo de envelhecimento. É preciso que os ossos e a cartilagem apoiem o envelhecimento do corpo, embora as células que os produzem se tornem menos ativas com o tempo. Outros órgãos, tais como os rins, o coração e o fígado devem ser operados para ter um tempo de vida maior [SCHEFFLER e COLOMBO, 2005].

Procedimentos cirúrgicos para o reparo de perda de tecido devido a algum trauma ou extração de tecido doente envolvem implantes de enxerto (transplantes), que podem ser doados de um sítio do mesmo paciente (autoenxerto), de outro ser humano (homoenxerto) ou de outras espécies (xenoenxertos).

Tanto nos homoenxertos quanto nos xenoenxertos, há a possibilidade de transmissão de doenças, o que faz com que haja uma grande demanda para substitutos sintéticos especialmente projetados e fabricados para agir como um scaffold (arcabouço tridimensional poroso) na regeneração de tecidos para seu estado natural e suas funções, que é fundamental para a engenharia tecidual [SCHEFFLER e COLOMBO, 2005].

Os scaffolds normalmente possuem propriedades osteocondutivas, e raramente propriedades osteoindutivas ou osteogênicas, além de possuírem a grande vantagem de servir de suporte mecânico [BLOM, 2007].

Quando utilizados para regeneração do tecido ósseo, os scaffolds podem ser classificados em dois tipos: arcabouços que induzem a migração e o crescimento celular, provenientes de tecidos vizinhos, para a formação de tecido ósseo; arcabouços carreadores de células osteogênicas autógenas, que foram colonizadas em biorreatores e subsequentemente reimplantadas no paciente [BURG; PORTER; KELLAM, 2000].

Eles podem ser de origem natural, como as cerâmicas, a exemplo do coral; sintéticos bioabsorvíveis, como o PGLA (Poli ácido glicólico - ácido lático), caprolactama (CPL) e cerâmicas porosas; ou híbridos [AHSAN; NEREM, 2005; HUTMACHER et al., 2007].

A engenharia tecidual (também chamada de engenharia de tecidos) tem sido desenvolvida para substituir, reparar ou reconstruir tecidos ou órgãos perdidos ou danificados por acidentes ou doenças graves [LANGER, 2000].

Esse processo é relativamente complexo, e por conta disso, a engenharia tecidual é um campo multidisciplinar que envolve a aplicação de princípios e métodos da engenharia e das ciências da saúde para assistir e acelerar a regeneração e o reparo de tecidos defeituosos ou danificados, através de melhorias nas terapias já existentes, [TABATA, 2009; HENCH et al., 2006].

Deste modo, essa ciência visa criar e aprimorar novas terapias e/ou desenvolver novos biomateriais que restaurem, melhorem ou impeçam o agravamento da função tecidual comprometida, o que resulta em redução significativa de custos [KAIGLER; MOONEY, 2001; SACHLOS; CZERNUSZKA, 2003; MARINS et al., 2004].

Vários materiais vêm sendo desenvolvidos para utilização em implantes cirúrgicos e dispositivos médico-odontológicos. Hench [1998] indicou que, devido às limitações da utilização de enxerto ósseo autógeno, materiais sintéticos para essa aplicação vêm sendo pesquisados com uma alternativa de tratamento e lesões em tecido ósseo. Para isso, são criados suportes de crescimento tecidual (scaffolds) que são biorreabsorvíveis.

Os eventos que são esperados que os implantes promovessem nos tecidos vivos são: (a) habilidade de se auto-reparar; (b) capacidade de manutenção do suprimento sanguíneo; e (c) a alteração da sua estrutura em resposta a fatores ambientais.

Espera-se, ainda, que os novos biomateriais possam, através da interação entre biologia e engenharia, promover um reparo tecidual por um tempo mais longo do que a limitada expectativa de vida para os implantes humanos [HENCH et al., 2000].

Dentre os biomateriais que foram desenvolvidos, e vem sendo aperfeiçoados estão alguns polímeros (poli(-Caprolactona), poli(metacrilato de metila), etc.), cerâmicas (hidroxiapatita), vidros bioativos (Bioglass®), compósitos (Poli(-Caprolactona) (PCL) e β-Fostato Tricálcico (β -TCP) [SOLOMÃO, 2011], hidroxiapatita-titânia [GOMIDE, 2005], etc.

Segundo Coelho e colaboradores (2002) e Valerio e colaboradores (2004), as características que os biomateriais devem possuir são:




  1. Biocompatibilidade: o material deve ser atóxico, não promover reação de inflamação aguda ou crônica, ter uma baixa reatividade tecidual, ou seja, não promover rejeição do hospedeiro;

  2. Bioabsorção: o material deve possuir degrababilidade que irá acompanhar a formação de um novo tecido;

  3. Porosidade: o material deve possuir uma densidade de poros em torno de 75% com tamanhos médios de 200 a 400 m de diâmetro, onde os poros devem ser interconectados, possuir grande área superficial, para favorecer a adesão protéica, além de aumentar a formação de colágeno;

  4. Quimiotaxia: o material deve atrair células mesenquimais e fornece meios de adesão celular, facilitando a proliferação e a diferenciação celulares;

  5. Angiogênese: o material deve promover vascularização, sendo hidrofílico, para absorver fluido sanguíneo e reforçar a coagulação inicial após a implantação;

  6. Baixo custo: o material não pode exceder o valor do autoenxerto, possuindo materiais constituintes em abundância e uma esterilização eficiente.

Para que sejam desenvolvidos scaffolds, algumas características devem ser levadas em conta, a saber:




  1. Devem suportar a deposição e crescimento celular;

  2. Devem possuir uma taxa de degradação controlada a fim de suportar as duas fases de desenvolvimento tecidual (in vitro e in vivo), sem perder as propriedades mecânicas necessárias para substituir o tecido perdido;

  3. Devem ter uma taxa de degradação de tal forma que haja espaço suficiente para o tecido se desenvolver, à medida que o material é reabsorvido [RATNER et al., 1996].

Os biomateriais interagem com o ambiente do tecido em que são implantados, podendo ter interações onde há os seguintes efeitos: a) do implante sobre o hospedeiro; e b) do hospedeiro sobre o implante [ANDERSON et al., 1996].

Os efeitos do implante no hospedeiro podem ser: a) local (interação entre sangue – material, toxicicade, infecção, etc.); e b) sistêmica e remota (hipersensibilidade, elevação dos elementos do implante no sangue, etc.), enquanto que os efeitos do hospedeiro no implante podem ser: a) efeitos físico-mecânicos (desgaste abrasivo, fadiga, corrosão, degeneração, etc.); e b) efeitos biológicos (calcificação, degradação enzimática, etc.) [ANDERSON et al., 1996].

Essas etapas são as fases desejáveis para integração do implante ao organismo vivo. Contudo, a presença do biomaterial pode acarretar em processos indesejáveis para interação com o tecido, estimulando uma resposta inflamatória, levando a uma agressão no local de implantação. Nesse processo inflamatório, a resposta do hospedeiro ao biomaterial promove a liberação de mediadores químicos que desencadearão processos tais como a vasodilatação, com aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de líquido intravascular. Este exsudado, com vários mediadores químicos, pode ativar células vizinhas e outros vasos sanguíneos, determinando a liberação de outros fatores pré-inflamatórios e o recrutamento celular [ANDERSON et al., 1996].

A inflamação aguda pode evoluir para um processo crônico, com a permanência do estímulo, promovendo o recrutamento e a diferenciação de fibroblastos, assim como sua ativação, o que dá início ao processo de reparo ou remodelagem do tecido [BAYLEY, 1988]. Também é possível que esses fibroblastos formem um depósito de tecido conjuntivo denso e colagenoso em torno do material, encapsulando e isolando o implante do tecido circunvizinho. Com isso, não há possibilidade de integração do tecido ao biomaterial, o que é considerado como uma resposta negativa à sua presença no organismo e à sua função de proliferação celular [ANDERSON et al., 1996].

Outra estratégia é a combinação de células, que são elementos fundamentais durante o reparo e regeneração com o biomaterial. Com a utilização de uma linhagem de células apropriadas, seria possível prever as respostas celulares com técnicas de proliferação e diferenciação dessas [HENCH; POLAK, 2002].

Atualmente, a engenharia tecidual vem permitindo a utilização de células do próprio paciente, de doadores e células-tronco fetais ou de adultos, cultivados em scaffolds de materiais compatíveis com o organismo. Essa metodologia aparece como uma boa alternativa para aplicações médicas pelo benefício ao paciente, uma vez que, a partir de um pequeno número de células, via expansão em culturas in vitro, podem minimizar a rejeição dos implantes [KELLOMAKI et al., 2004; MAY et al., 2007].

Este trabalho objetivou avaliar toxicidade e crescimento de células nos suportes porosos de HA-TiO2.


2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
A hidroxiapatita (HA) utilizada neste trabalho foi gentilmente cedida pela empresa Inside Materiais Avançados Ltda., localizada em Belo Horizonte, MG. Foram realizados ensaios de fluorescência de raios-X, com o intuito de identificar o percentual de elementos químicos presentes, além das temperaturas onde ocorreu mudança de fases. A Fluorescência de Raios-X foi realizada em um espectrômetro de fluorescência de raios-x Rigaku RIX 3100, pertencente ao Departamento de Engenharia de Materiais (DEMA) da Faculdade de Engenharia Mecânica (FEM) da Unicamp. Os percentuais dos elementos químicos presentes na hidroxiapatita estão indicados na Tabela 1.
Tabela 1 – Resultados de fluorescência de raios-x da hidroxiapatita, como recebida.

Componente

Quantidade em massa (%)

O

45,428

Ca

37,168

P

17,018

Mg

0,131

Sr

0,083

Si

0,051

Al

0,045

Fe

0,022

S

0,019

Na

0,017

K

0,013

Ni

0,005

A titânia comercial utilizada neste trabalho foi fabricada pela Kronos Indústria de Abrasivos Ltda. Assim como aconteceu com a hidroxiapatita, foram realizados ensaios de fluorescência de raios-x, difração de raios-x e análise termogravimétrica sobre a amostra, com o intuito de identificar o percentual de elementos químicos presentes, além das temperaturas onde ocorreu mudança de fases.

Os resultados da fluorescência de raios-x (FRX) estão indicados na Tabela 2 a seguir.
Tabela 2 – Resultados de fluorescência de raios-x para a titânia, como recebida.

Componente

Quantidade em massa (%)

TiO2

95,084

Al2O3

3,586

SiO2

1,106

Na2O

0,115

SO3

0,033

CaO

0,028

P2O5

0,023

Fe2O3

0,009

NiO

0,009

As2O3

0,007

A esponja polimérica utilizada foi uma esponja de poliuretano, adquirida no comércio de Campinas, SP, e a sua estrutura de poros pode ser vista na Figura 1.


Figura 1 – Distribuição e forma dos poros para a esponja comercial de poliuretano. A parte (a) mostra uma visão geral da esponja (aumento de 15x), enquanto que a parte (b) mostra a geometria dos poros.


Foram utilizados bicarbonato de sódio NaHCO3 da Merck, álcool comercial da Cooperalcool INPM 92,8º e água destilada, todos gentilmente cedidos pelo laboratório de biomecânica (Labiomec) da Faculdade de Engenharia Mecânica (FEM) da Unicamp.
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